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提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑四:液體 1mL×1 管,4℃避光保存。
標準品:粉劑 3mg×1 管,4℃避光保存
長時程增強功能具有重要的調(diào)節(jié)作用,并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應。
H2S 與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應生成亞甲基藍,亞甲基藍在 665nm 處有最大吸收峰,通過測定其吸光值可計算 H2S 含量。
天平、低溫離心機、可見分光光度計或酶標儀、微量比色皿或96孔板、蒸餾水。
一、樣品處理:
a. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL
提取液)進行冰浴勻漿,然后 10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
b. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(10 4 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 10000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。
c. 血清(漿):直接測定。
二、測定步驟: (取 1.5ml 離心管,按照下表操作)
空白管 | 測定管 | 標準管 | |
樣品(μL) | 50 | 50 | |
蒸餾水(μL) | 50 |
試劑一(μL) | 50 | 50 | 50 |
充分震蕩混勻 | |||
試劑二(μL) | 50 | 50 | 50 |
充分震蕩混勻 | |||
試劑三(μL) | 50 | 50 | 50 |
充分震蕩混勻 | |||
試劑四(μL) | 10 | 10 | 10 |
12000rpm,4℃,離心 10min,取200μl上清混勻,25℃靜置20min,于比色皿中,測定665nm吸光值,記為A空白、A測定、A標準。 |
三、H2S 含量計算公式:
(1) 按蛋白濃度計算
H2S含量(μmol /mg prot)=0.125×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白) ÷Cpr
(2) 按樣本質(zhì)量計算
H2S含量(μmol /g)=0.125×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白) ÷W
(3) 按細胞數(shù)量計算
H2S含量(μmol /104 cell)=0.125×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數(shù)量
(4) 按照液體體積計算
H2S含量(μmol /mL)=0.125×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)
注意事項:如樣本OD值大于標準品OD,可稀釋樣本或增大標準品濃度