|
|
一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測定試劑盒說明書
微量法
注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
NO(Nitric Oxide,NO)廣泛分布于生物體內神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中,特別是神經組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質,發揮信號傳遞的作用,是一種新型的生物信使分子,在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理:
NO在體內或水溶液中極易氧化生成 NO2-,在酸性條件下,NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物,進一步與萘基乙烯基二胺偶合,產物在550nm處有特征吸收峰,測定其吸光值,可以計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響,每個樣品需做對照管。
自備實驗用品及儀器:
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 3mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體 3mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體 6mL×1 瓶,4℃避光保存。
樣品處理:
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿。10000g,4℃離心 15min,取上清,置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心 15min,取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養液等其它液態樣品:直接測定。
測定步驟和操作表:
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至550nm。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 100 | 100 |
試劑一(μL) | 50 | |
試劑二(μL) | 50 | |
試劑三(μL) | 50 | 50 |
混勻,室溫靜置 15min,于微量石英比色皿/96 孔板,對照管調零,測定 550nm 處吸光 值,記為 A 550 。 |
NO 含量計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為:y=0.016x-0.0103,R2=0. 9986
1、組織樣品:
NO含量定義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-,相當于1μmoL NO。
(1)按樣本質量計算
NO 含量(μmoL/g)=(A 550 +0.0103)÷0.016×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10 -3
= 0.125×(A 550 +0.0103)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
NO 含量(μmoL/mg prot)=(A 550 +0.0103)÷0.016×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10 -3
= 0.125×(A 550 +0.0103)÷Cpr
2、其他樣品:
NO 含量定義:25℃時,每升樣品15min生成 1μmoL NO2-,相當于1μmoL NO。
NO 含量(μmoL/L)=(A 550+0.0103)÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125×(A 550+0.0103)
V 反總:反應總體積,0.2mL;V 樣:反應中樣品體積,0.1mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為:y= 0.008x-0.0103,R2=0. 9986
1、組織樣品:
NO含量定義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-,相當于1μmoL NO。
(1)按樣本重量計算
NO 含量(μmoL/g)=(A 550 +0.0103)÷0.008×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10 -3
= 0.25×(A 550+0.0103)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
NO 含量(μmoL/mg prot)=(A 550+0.0103)÷0.008×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10 -3
= 0.25×(A 550+0.0103)÷ Cpr
2、細胞
NO 含量定義:25℃時,每104個細胞15min 生成 1μmoL NO2-,相當于1μmoL NO。
NO 含量(μmol/104cell)=(A 550+0.0103)÷0.008×V反總÷(V樣÷V樣總×細胞數量)×10 -3= 0.25×(A 550+0.0103)÷細胞數量(萬個)
3、 其他樣品:
NO 含量定義:25℃時,每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2-,相當于1μmoL NO。
NO 含量(μmoL/L)=(A 550 +0.0103)÷0.008× V 反總÷V 樣= 250×(A 550 +0.0103)
V 反總:反應總體積,0.2mL;V 樣:反應中樣品體積,0.1mL;V 樣總:加入提取液體積,
1mL;W:樣品質量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL