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為了驗證低甲烷和高甲烷產(chǎn)生者對不可消化碳水化合物的反應(yīng)是否不同的假設(shè)，進(jìn)行了一項研究。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Puschino繁殖場（SPF狀態(tài)）的Wistar大鼠是低甲烷產(chǎn)生者，而Stolbovaya繁殖場的常規(guī)大鼠是高甲烷產(chǎn)生者。在每個繁殖場的25只大鼠中，評估了氫氣和甲烷呼吸測試以及腸道菌群的分類內(nèi)容。使用僅鼻部裝置從清醒的大鼠那里采集呼出的空氣樣本，并通過氣相色譜法進(jìn)行分析。每只大鼠的腸道菌群分類內(nèi)容通過16S rRNA方法進(jìn)行評估。乳果糖、瓜爾膠和菊粉以每周時間間隔通過灌胃法給予每只大鼠。在碳水化合物給藥后的8小時內(nèi)測量呼出空氣樣本中的氫氣和甲烷水平。不同組之間的分類微生物組構(gòu)成差異很大。低甲烷產(chǎn)生大鼠具有較低的α和β多樣性，Christensenellaceae和Akkermansia細(xì)菌豐度較高，Helicobacteraceae豐度較低，且沒有Methanobacteriaceae，這與新生兒和兒童的微生物組相似。高甲烷產(chǎn)生大鼠（來自Stobovaya繁殖場）的微生物菌群多樣性要高得多，像Helicobacteraceae和Methanobacteriaceae這樣的耗氫微生物豐度更高，接近老年人的微生物組成。低甲烷產(chǎn)生大鼠灌胃碳水化合物后，只有呼出空氣中的氫氣水平增加，而相同的碳水化合物只在甲烷水平上引起增加。我們推測，外源性氫氣（富含氫氣的水）的給藥將更有效地提高老年人的抗氧化防御能力，因為食用食物纖維并不會導(dǎo)致血液中氫氣水平的增加。 介紹 在科學(xué)界廣泛討論了腸道菌群不僅參與胃腸疾病的發(fā)病機(jī)制——克羅恩病、腸易激綜合癥、腹瀉等，還涉及肥胖癥[1]、動脈粥樣硬化[2]、2型糖尿病[3]、心力衰竭[4]、動脈性高血壓[5]等疾病的發(fā)展中。宏基因組學(xué)研究可以檢測到腸道微生物組中的大量微生物，但它們不能評估每個檢測到的微生物或其群體和群落的功能或代謝特征。代謝組學(xué)研究，即由菌群產(chǎn)生的低分子量生物標(biāo)志物的研究，吸引了科學(xué)界的大量關(guān)注。這樣的生物標(biāo)志物包括氣體，如氫氣、甲烷、硫化氫，以及短鏈脂肪酸（SCFA）和其他低分子量揮發(fā)性物質(zhì)[6]。已經(jīng)表明，氫氣是由腸道菌群專門產(chǎn)生的，而不是宿主的體細(xì)胞[7, 8]。長時間以來，生物甲烷的形成被認(rèn)為是只有產(chǎn)甲烷古菌才能產(chǎn)生的。然而，近年來在體外實驗中表明，在缺氧條件下，人類細(xì)胞系也能產(chǎn)生甲烷[9]。幾乎70%列入人體微生物組項目胃腸道（HMP GI）參考基因組數(shù)據(jù)庫的微生物物種編碼了氫化酶，這對于展示產(chǎn)氫（產(chǎn)生氫氣）或耗氫（消耗氫氣）活性是必需的[10]。檢查胃腸道中氫氣產(chǎn)生的最初測試之一是乳果糖呼吸測試。乳果糖是人類不消化的碳水化合物。當(dāng)給予人類或嚙齒類動物時，乳果糖將穿過腸道，直到到達(dá)能夠消化該底物的腸道菌群庫。作為發(fā)酵的副產(chǎn)物，產(chǎn)生了氫氣。氫氣（以及其他腸道產(chǎn)生的氣體）進(jìn)入血液，循環(huán)，擴(kuò)散到肺泡空間，并在呼吸中呼出[11]。 根據(jù)對正常受試者的研究，屁的主要成分包括：氫氣（3-20%）、二氧化碳（9-14%）、甲烷（7.2%）、氧氣（2-4%）和硫化氫（0.00028%）[12, 13]。腸道微生物群中的古菌會代謝氫氣。兩種主要的甲烷產(chǎn)生物種——Methanobrevibacter smithii和Methanosphaera stadtmanae在人類結(jié)腸中是主要產(chǎn)甲烷菌。它們的數(shù)量沿著結(jié)腸增加，直到在直腸達(dá)到最大值。Methanobrevibacter smithii利用氫氣將二氧化碳還原為甲烷，而Methanosphaera stadtmanae利用氫氣將甲醇還原為甲烷。合成一分子甲烷需要四個氫分子和一個二氧化碳分子：CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O [14, 15]。 直到2007年，氫氣(氫氣)被認(rèn)為是生理上惰性的氣體。太田成男教授及其同事在《自然》雜志上發(fā)表了關(guān)鍵性文章，證明了氫氣的抗氧化活性[16]。在過去的二十年里，來自臨床前和臨床研究的積累證據(jù)表明，氫氣可能作為一種抗氧化劑，對包括代謝性疾病在內(nèi)的各種疾病發(fā)揮治療和預(yù)防作用[17]。此外，獲得的證據(jù)顯示，氫氣影響信號通路，通過這些通路信息傳遞穿過細(xì)胞膜，并且還具有細(xì)胞保護(hù)作用，減少促炎細(xì)胞因子的合成和細(xì)胞凋亡。隨后進(jìn)行的臨床試驗在很大程度上證實了之前在動物身上實驗研究的結(jié)果，從而確認(rèn)了氫氣的心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)效果，以及對內(nèi)皮功能障礙的積極影響[18, 19]。 一方面，氫氣積極效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了研究外源性氫氣效應(yīng)的研究數(shù)量增加；另一方面，也重新激發(fā)了對腸道微生物群產(chǎn)生的內(nèi)源性氫氣效應(yīng)分析的興趣。 幾項研究表明，健康個體可以根據(jù)碳水化合物引發(fā)的氫氣和甲烷產(chǎn)量被分為三個條件亞組。第一組在乳果糖給藥后呼出的空氣中氫氣和甲烷水平較低。第二組，甲烷陽性，甲烷增加而氫氣幾乎沒有增加。第三組只觀察到氫氣水平的增加[20, 21]。使用不同結(jié)構(gòu)的不可消化膳食纖維作為益生元是一種安全有效的方法，可以改善微生物群的功能狀態(tài)，因為它們是產(chǎn)生氫氣微生物的主要底物[22,23,24]。 因此，我們的研究旨在調(diào)查是否可以通過使用不同的不可消化碳水化合物來增加低產(chǎn)甲烷和高產(chǎn)甲烷大鼠的內(nèi)源性氫氣產(chǎn)量，從而提高機(jī)體的抗氧化防御能力。 材料和方法 實驗動物 根據(jù)歐洲議會和歐洲聯(lián)盟理事會關(guān)于保護(hù)用于科學(xué)目的動物的2010/63/EU指令，對動物的飼養(yǎng)和所有操作均按規(guī)定執(zhí)行。實驗方案已由莫斯科國立大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（申請編號129-Zh，日期為2021年5月31日）。動物來自兩個不同的養(yǎng)殖場。第一批，25只大鼠——來自“普希諾”實驗室動物養(yǎng)殖場（生物有機(jī)化學(xué)科學(xué)研究所，莫斯科地區(qū)）。根據(jù)證書，Wistar大鼠具有SPF狀態(tài)。第二批，25只大鼠——來自實驗室動物分部“斯托爾博瓦亞”（俄羅斯聯(lián)邦醫(yī)療生物學(xué)局，莫斯科區(qū)）。這些大鼠符合遺傳標(biāo)準(zhǔn)，這一點通過質(zhì)量證書得到了確認(rèn)。 動物到達(dá)后立即被放置在動物房內(nèi)，檢查是否有傷口、疼痛和/或不適的跡象，并被安置在T3籠中，每籠2只大鼠。動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，光照時間為12小時，可無限量獲取水和食物，并且定期控制室內(nèi)溫度和濕度。適應(yīng)動物房條件的時間至少為7天。為了實施實驗操作并避免壓力對研究結(jié)果的影響，所有動物都經(jīng)過了處理程序。 胃內(nèi)給藥 所有調(diào)查物質(zhì)均通過灌胃法使用無菌胃內(nèi)管（尺寸16，適用于200-300克重的大鼠）給藥。對于每個動物組，“普希諾”和“斯托爾博瓦亞”，都使用了單獨的胃內(nèi)管，以盡量減少微生物群在組間的轉(zhuǎn)移。 用于氫氣/甲烷呼氣試驗的飲食化合物 乳果糖（Fresenius Kabi IPSUM S.r.l.，意大利）。乳果糖（2克/公斤體重，通過灌胃）是一種二糖，由半乳糖和果糖殘基組成。 PHGG（部分水解瓜爾膠，4克/公斤，Optifiber ®，雀巢健康科學(xué)，德國）。其主要成分是刺梧桐果實提取物，即瓜爾膠?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)是100%瓜爾半乳甘露聚糖，由甘露糖和半乳糖以大約2:1的比例組成。 菊粉（蛋白公司，俄羅斯）。菊粉是一種D-果糖的聚合物，由30-35個呋喃糖形式的果糖殘基組成。菊粉以4克/公斤劑量給藥。 給藥物質(zhì)的重量是根據(jù)動物的體重計算的。所有物質(zhì)在給藥前都溶解在2-3毫升純凈水中。每種類型的不可消化碳水化合物都在兩組的每只大鼠上進(jìn)行了測試。每只大鼠的連續(xù)測量時間間隔為一周，以排除先前測試的影響。 呼出氣體樣品采集實驗設(shè)計 實驗裝置采用了生命支持系統(tǒng)的改進(jìn)版本，用于氫氣的定量收集[25]，但我們沒有將大鼠放置在密封的動物室中，而是使用了一種帶有Allay?約束領(lǐng)的Rat Breathalyzer系統(tǒng)[26]的版本，以便于采集呼出氣體樣本，測量氫氣和甲烷的水平[27]（見圖20.1）。在本研究中，Allay?約束領(lǐng)與通風(fēng)的僅限鼻子的腔室結(jié)合使用。該裝置是由合著者之一（Bondarenko G.）構(gòu)建的。 圖20.1實驗裝置示意圖，用于收集實驗中全部空氣樣本。1—氣瓶箱，2—空氣泵，3—玻璃注射器，4—吸濕劑（水凝膠），5—二氧化碳吸收劑（蘇打石灰），6—壓力計，7—氧氣瓶，8—氣體減壓閥；B 動物籠的照片：1—兩個腔室分隔平面上的橡膠膜孔，2—動物頭部放置腔室，用于動物重復(fù)呼吸，3—動物身體放置腔室，用于固定動物的頸部區(qū)域 氣體實驗裝置由三個關(guān)鍵部分組成——氣瓶箱、生命支持系統(tǒng)和循環(huán)通風(fēng)系統(tǒng)。動物的頭部用頸部塑料夾固定，僅從上方和側(cè)面緊密貼合頸部區(qū)域，這允許動物自由呼吸。大鼠的鼻子位于一個特殊的頭部隔間內(nèi)，周圍緊密貼合橡膠膜。這樣，裝置的密封性得到保證，呼出的空氣在系統(tǒng)內(nèi)部循環(huán)，不會逸出。頭部隔間內(nèi)有輸入和輸出連接器。 通過過濾器循環(huán)的呼出空氣被清除了水分和二氧化碳。氧氣水平維持在20-21%。這樣，氫氣和甲烷的積累就發(fā)生了，這對于測量氣體裝置系統(tǒng)中的氣體濃度是必要的。進(jìn)氣通過密封閥進(jìn)行，使用特殊的氣密型Hamilton注射器進(jìn)行氣相色譜分析。我們系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，我們能夠收集到未受脹氣干擾的僅呼出的空氣，這使我們的系統(tǒng)類似于人類呼吸測試中的采樣空氣。 空氣樣本是在動物12小時后采集的，當(dāng)時大鼠可以自由飲水。然后，將動物從籠子中取出，并通過灌胃法給予特定碳水化合物溶液。在每只大鼠中，呼出空氣樣本共收集五次：基線、碳水化合物給藥后2、4、6和8小時。每次采樣后，大鼠被送回其籠中，直到下一個時間點。為了排除不同難消化碳水化合物在腸道微生物群中的交叉作用，大鼠在用另一種難消化碳水化合物進(jìn)行測量前，會在標(biāo)準(zhǔn)飲食中保持幾天。 樣本分析 在氣體色譜儀（TRILyzer mBA-3000，日本）上進(jìn)行了呼出空氣中氫氣、甲烷和一氧化碳的測定，使用含有低濃度（空氣中氫氣、甲烷和一氧化碳，每種5ppm）和高濃度（氫氣、甲烷和一氧化碳—空氣中每種50ppm）的氣體進(jìn)行校準(zhǔn)。 繪制了氫氣和甲烷的濃度-時間曲線，并計算了AUC 0-8小時曲線下的面積（ppm*h），這反映了實驗8小時內(nèi)氣體生成的速率。 糞便樣本收集 糞便樣本收集在單個Eppendorf管中。Eppendorf管立即蓋上蓋子，標(biāo)記并冷凍在-80°C。對于每只動物，一次取兩個糞便樣本。取樣是在呼吸測試前夕進(jìn)行的。 微生物群落組成分析 使用QIAampPowerFecal Pro DNA Kit（Qiagen，Hilden，德國）按照制造商的說明從糞便中分離DNA。通過熒光計（Thermo Fisher Scientific，MA，美國）評估DNA的數(shù)量和濃度。使用1-2 ng的DNA進(jìn)行文庫準(zhǔn)備。使用引物515F [28]和Pro-mod-805R [29]通過兩步PCR制備16S rRNA V4高變區(qū)擴(kuò)增子文庫。 每個DNA樣本的PCR都是根據(jù)之前的協(xié)議[30]進(jìn)行的。在Veriti熱循環(huán)儀（Applied Biosystems，MA，美國）上進(jìn)行擴(kuò)增。得到的文庫在瓊脂糖凝膠上檢查并等摩爾混合。最終混合物使用QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen，德國）按照制造商的協(xié)議純化。 使用個人測序系統(tǒng)（Illumina，San Diego，CA，美國）進(jìn)行測序，2×156bp配對末端。 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析和隨機(jī)分組是使用GraphPad Prism 8軟件完成的。使用Shapiro-Wilk標(biāo)準(zhǔn)檢驗分布的正態(tài)性。對于頻率超過3個測量點以上的呼吸測試結(jié)果，采用曲線下面積（AUC）計算進(jìn)行比較。使用單因素單方向方差分析（ANOVA）比較多于兩個樣本中單個指數(shù)的平均值。為了確定組別和暴露持續(xù)時間的同時效應(yīng)，以及這些因素之間的相互作用，使用雙因素ANOVA方差分析來識別組間差異，通過配對和非配對t檢驗分別分析相關(guān)樣本和獨立樣本。對于非正態(tài)分布的組間成對比較，使用Wilcoxon檢驗分析相關(guān)樣本，Mann-Whitney檢驗分析獨立樣本。使用Spearman等級相關(guān)系數(shù)計算相關(guān)性。使用ROUT標(biāo)準(zhǔn)排除統(tǒng)計異常值，Q值不超過1%。在p < 0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）呈現(xiàn)。微生物群落組成、alpha和beta多樣性指標(biāo)和統(tǒng)計使用R（版本4.2.0）進(jìn)行分析。高質(zhì)量讀取對使用DADA2管道[29]處理，根據(jù)已發(fā)布的協(xié)議[31]執(zhí)行。使用Silva138數(shù)據(jù)庫[32]，通過樸素貝葉斯分類器確定擴(kuò)增序列變體（ASVs）的分類。為了進(jìn)一步分析，使用Phyloseq包[33]對讀取進(jìn)行稀薄化處理。獲得的ASV參考序列、樣本元數(shù)據(jù)、豐度表和分類導(dǎo)入到Phyloseq包中，所有后續(xù)操作都在Phyloseq對象上執(zhí)行。使用microeco包（基于距離矩陣的多變量方差分析）[34]和vegan包[35]進(jìn)行微生物群落組成的可視化。 結(jié)果 不同結(jié)構(gòu)單一碳水化合物負(fù)載（乳果糖、菊粉、PHGG纖維）對大鼠呼出氣中氣體標(biāo)記物（氫氣和甲烷）含量的影響 在“Puschino”實驗組中，使用乳果糖溶液和PHGG纖維時，氫氣和甲烷水平有顯著差異，p < 0.0001和p = 0.001，分別（圖20.2a）。在菊粉組中，氫氣和甲烷的水平大致相同（約35-40 ppm*h），差異不顯著，p = 0.6（圖20.2a）。在“Stolbovaya”實驗組中比較氫氣和甲烷水平時，所有實驗組中氣體代謝物水平的差異均達(dá)到高度顯著性，p < 0.0001（圖20.2b）。平均而言，所有實驗組中甲烷水平比氫氣水平高出12倍，氫氣的總平均水平為25 ± 8 ppm*h（乳果糖35 ± 23 ppm*h，PHGG 18 ± 13 ppm*h，菊粉22 ± 13 ppm*h），甲烷的平均水平為320 ± 38 ppm*h（乳果糖334 ± 122 ppm*h，PHGG 276 ± 134 ppm*h，菊粉350 ± 156 ppm*h）（圖20.2b）。 圖20.2 顯示了在“Puschino”組和“Stolbovaya”組的大鼠中，單次灌胃不同結(jié)構(gòu)非消化性碳水化合物（乳果糖、PHGG和菊粉）后呼出氣中氫氣和甲烷的比較。 當(dāng)比較最初具有不同氫氣產(chǎn)生活性微生物群的大鼠時，發(fā)現(xiàn)這些大鼠對某些碳水化合物的氫氣反應(yīng)不同。因此，在“Puschino”組的大鼠中，與“Stolbovaya”組的大鼠相比，乳果糖和PHGG組中氫氣產(chǎn)生的顯著增加分別為1.9倍和2.7倍，p < 0.0001（圖20.3a）。對于最初具有高氫潛力的大鼠來說，菊粉的反應(yīng)比“Stolbovaya”組的大鼠高出1.4倍，但這個差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，p = 0.2（圖20.3a）。 對于最初具有不同甲烷生成活性基線的大鼠組，單次灌胃非消化性碳水化合物的甲烷反應(yīng)也有所不同。在“Stolbovaya”組中，與“Puschino”組的大鼠相比，單次應(yīng)用非消化性碳水化合物后的甲烷水平高出11.5倍或更多（使用乳果糖高出12倍，PHGG高出11.5倍，菊粉高出14倍），p < 0.0001（圖20.3b）。 圖20.3 比較了“Puschino”和“Stolbovaya”組的大鼠在單次灌胃不同非消化性碳水化合物后呼出氣中的a 氫氣和b 甲烷水平。 所有最初具有基礎(chǔ)氫潛力且沒有明顯甲烷生成活性的“Puschino”組大鼠，對所有類型額外飲食化合物的單次應(yīng)用都有氫氣反應(yīng)（圖20.4）。氫氣產(chǎn)生的增加按以下順序：菊粉 → PHGG → 乳果糖。記錄到的最大氫氣產(chǎn)生是在注射乳果糖的情況下。所有組之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，PHGG與菊粉組之間的顯著性水平為p = 0.03，乳果糖與PHGG組之間為p = 0.009，乳果糖與菊粉組之間為p < 0.0001（圖20.4a）。同時，在使用所有非消化性碳水化合物時，既沒有記錄到相對于“空腹”狀態(tài)（零測量點）的甲烷水平的顯著增加，也沒有記錄到呼出氣中甲烷水平之間的組間差異，所有組之間的顯著性水平p > 0.9（圖20.4b）。 在“Stolbovaya”組的大鼠中，記錄到了高的甲烷生成活性（圖20.4b）和低的氫潛力（圖20.4a）。當(dāng)使用與“Puschino”組大鼠相同的非消化性碳水化合物時，大鼠的反應(yīng)完全相反。在任何實驗組中都沒有記錄到氫氣的增加，而且氫氣的基線水平也非常低，p > 0.9（圖20.4a）。 對所有三個組的纖維應(yīng)用的甲烷生成反應(yīng)都很高，并且在PHGG → 乳果糖 → 菊粉系列中一致增加。只在PHGG和菊粉組之間發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，p = 0.03。乳果糖與PHGG組之間以及乳果糖與菊粉組之間的差異分別為p = 0.1和p = 0.9（圖20.4b）。 圖20.4 顯示了在“Puschino”和“Stolbovaya”組的大鼠中，單次使用不同非消化性碳水化合物后呼出氣中的a 氫氣和b 甲烷水平比較。 腸道微生物群組成分析 在去復(fù)用和讀取預(yù)處理之后，每個樣本重復(fù)平均獲得了19,201個讀取對。經(jīng)過DADA2處理步驟（額外過濾、去噪、合并和嵌合體移除）后，每個重復(fù)的平均讀取計數(shù)為15,017。稀化分析顯示所有測序樣本都具有良好的飽和度，這表明測序深度足夠。DADA2流程產(chǎn)生了1854個擴(kuò)增序列變體（ASVs）。 微生物多樣性分析 通過微生物組學(xué)包進(jìn)行的alpha多樣性指標(biāo)分析顯示，觀察到的ASV數(shù)量，以及Shannon和逆向Simpson指數(shù)，在“Stolbovaya”組中顯著高于“Puschino”組（p < 0.001）（圖20.5A）。通過vegan包的adonis2函數(shù)使用Bray-Curtis距離進(jìn)行的beta多樣性分析顯示，“Puschino”和“Stolbovaya”組的微生物群落彼此顯著不同（10,000次置換；F1, 96 = 88.36，p = 0.001），這通過PCoA分析也得到了清晰的支持（圖20.5B）。在1854個ASVs中，有717個是“Puschino”組特有的，843個是“Stolbovaya”組特有的，而294個ASVs在兩個實驗組中都被檢測到（圖20.5C）。 圖20.5 實驗組的多樣性分析。A 是alpha多樣性指標(biāo)比較分析的可視化；B 是“Puschino”和“Stolbovaya”組大鼠群體中細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析（PcoA）；C 是在實驗組中檢測到的ASVs的維恩圖。 微生物群落組成 在所有實驗組中，大鼠腸道菌群的群落組成主要由厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）所主導(dǎo)。在來自“Stolbovaya”組的糞便樣本中，Campylobacterota的數(shù)量顯著，而在“Puschino”組中幾乎未檢出。在兩個組中，擬桿菌目（Bacteroidia）和梭菌目（Clostridii）較為普遍。在目級別上，擬桿菌目（Bacteroidales）、螺旋體目（Oscillospirales）和Lachnospirales在兩組中均占主導(dǎo)地位。在其他細(xì)菌目中，乳桿菌目（Lactobacillales）在“Stolbovaya”組中占優(yōu)勢，而梭菌UCG-014群（Clostridia UCG-014）在“Puschino”組中更為普遍。 腸道菌群氣態(tài)代謝產(chǎn)物（氫氣和甲烷）水平與分類組成的相關(guān)性分析 通過冗余分析和Pearson相關(guān)性分析（在microeco包中進(jìn)行）來分析氣態(tài)代謝物（氫氣和甲烷）水平與微生物群落組成之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，“Stolbovaya”組糞便樣本中的微生物群落與甲烷水平相關(guān)，而“Puschino”組糞便樣本中高氫氣水平與微生物組成強(qiáng)烈相關(guān)（圖20.6）。在細(xì)菌類群中，與氫氣呈正相關(guān)的是擬桿菌屬（Bacteroides）、Alistipes和Enterococcus，而甲烷水平與普雷沃氏菌屬（Prevotella）、Prevotellaceae NK3B31群和Rickenellaceae RC9腸道群的代表呈正相關(guān)。 圖20.6 相關(guān)性分析。RDA排序圖展示了呼出氣中氣態(tài)代謝物（氫氣和甲烷）水平與實驗組中細(xì)菌屬相對豐度之間的關(guān)系。 討論 我們的研究顯示，來自兩個不同養(yǎng)殖場的大鼠在腸道菌群的分類組成和氫氣與甲烷產(chǎn)生比例方面可能存在顯著差異。 一組大鼠購自Puschino養(yǎng)殖場，具有SPF（無特定病原體）狀態(tài)。這些大鼠的微生物群落多樣性較低，通過微生物組進(jìn)行的alpha多樣性指標(biāo)分析顯示，Shannon和逆向Simpson指數(shù)與另一組（Stolbovaya）相比明顯較低（p < 0.001）。兩組研究中的微生物群落譜系差異很大。在Puschino組的1011個擴(kuò)增序列變體（ASVs）中，只有294個與Stolbovaya組的1137個ASVs共有。 偶然發(fā)現(xiàn)兩組大鼠之間存在的顯著差異，可能模擬了人類中高氫組和高甲烷組的情況[20, 21, 36]，為測試內(nèi)源性氫氣可用性可能取決于所攝取的不易消化碳水化合物的類型以及氫產(chǎn)生菌和甲烷產(chǎn)生菌的比例這一假設(shè)提供了基礎(chǔ)。 我們的研究結(jié)果顯示，在產(chǎn)氫大鼠組中，通過灌胃給予乳果糖、瓜爾膠或菊粉后，僅觀察到纖維依賴性的氫氣釋放增加。相反，將相同的碳水化合物灌胃給高產(chǎn)甲烷大鼠（Stolbovaya養(yǎng)殖場）后，觀察到呼出氣中甲烷的增加，而非氫氣。 據(jù)推測，腸道中的氫氣主要由屬于Firmicutes門的Ruminococcus spp.、Roseburia spp.、Clostridium spp.；屬于Bacteroidetes門的Bacteroides spp.等細(xì)菌產(chǎn)生[10, 37]。此外，超過200種致病菌可以產(chǎn)生氫氣[38]。飲食中包含不可消化的碳水化合物通常會導(dǎo)致腸道菌群產(chǎn)生的氫氣增加[7, 10, 23, 37, 39]。 嚙齒動物研究的結(jié)果揭示了不同群體實驗大鼠的腸道菌群產(chǎn)生的氫氣量在攝入相同膳食纖維的背景下存在顯著差異。因此，第一組大鼠的門靜脈血氫氣濃度為1.54 μmol/l，而第二組為17.4 μmol/l。 將產(chǎn)氫氣高的大鼠結(jié)腸菌群通過口服移植到第一組低氫氣產(chǎn)生的動物中，導(dǎo)致門靜脈中氫氣濃度從3.07增加到9.95 μmol/l，以及屬于Actinobacteria門的Bifidobacterium屬、Firmicutes門的Allobaculum屬和Bacteroidetes門的Parabacteroides屬細(xì)菌數(shù)量的增加。同時，屬于Bacteroidetes門的Bacteroides屬、Firmicutes門的Ruminococcus屬和Proteobacteria門的Escherichia屬的水平降低[40]。 比較產(chǎn)氫氣和產(chǎn)甲烷大鼠組之間的分類學(xué)差異表明，氫氣產(chǎn)生者的菌群組成接近于新生兒和幼兒的菌群組成。氫氣產(chǎn)生者的Christensenellaceae細(xì)菌豐度是已知的氫氣產(chǎn)生領(lǐng)導(dǎo)者的幾倍。 人類的年齡與Christensenellaceae和Christensenella的豐度呈負(fù)相關(guān)，表明年輕受試者攜帶更高相對豐度的Christensenellaceae和Christensenella[41]。Goodrich等人分析了416對雙胞胎的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)Christensenellaceae的豐度與低BMI相關(guān)，且將Christensenella minuta移植到無菌小鼠中可減少體重增加[42]。在產(chǎn)氫氣的大鼠中發(fā)現(xiàn)了Akkermansia基因，但在產(chǎn)甲烷的大鼠中沒有發(fā)現(xiàn)。Verrucomicrobia門的豐度和Akkermansia屬Akkermansiaceae muciniphila在健康人類中約占90%，占糞便菌群的約1%至3%，并在生命第一年內(nèi)定殖腸道。它的流行率可能會隨著年齡的增長或疾病狀態(tài)而降低[43]。 Akkermansia的基因組中含有豐富的氫化酶，如HypE、HypD、HypA、HypB、HypF、HypC、HybG和HupF，因此Akkermansia能夠催化分解和利用氫氣。因此，持續(xù)和充足的氫氣供應(yīng)可能促進(jìn)這種細(xì)菌作為營養(yǎng)物質(zhì)的傳播[44]。Everard等人展示了A. muciniphila的相對豐度與葡萄糖代謝的有利效果相關(guān)聯(lián)，而在肥胖和糖尿病小鼠及人類中減少[45]。 實驗表明，產(chǎn)氫的大鼠體內(nèi)的Helicobacteraceae細(xì)菌（包括Helicobacter pylori和Helicobacter ssp.）的數(shù)量比產(chǎn)甲烷的大鼠少四倍。Helicobacteraceae能夠氧化氫氣，導(dǎo)致腸道中氫的減少[38]。在產(chǎn)氫的大鼠組中，我們未能檢測到Methanobacteriaceae的豐度（可能是它們的水平低于我們方法的檢測限），但這些古菌在產(chǎn)甲烷的組中被發(fā)現(xiàn)。 因此，基于以下觀察結(jié)果（低alpha和beta多樣性、Christensenellaceae和Akkermansia細(xì)菌的高豐度、Helicobacteraceae的低豐度以及Methanobacteriaceae的缺失），我們可以假設(shè)高產(chǎn)氫的大鼠組可以作為年輕人類微生物群的模型。 無菌大鼠的實驗為長久以來的觀點提供了基礎(chǔ)，即甲烷和氫氣一樣，完全由腸道微生物群產(chǎn)生[46]。一些研究得出結(jié)論，人類的細(xì)胞也能產(chǎn)生甲烷，但所有支持這一結(jié)論的證據(jù)都是在體外獲得的，并且到目前為止還沒有通過體內(nèi)實驗得到證實?；谶@些數(shù)據(jù)，有人提出，除了微生物來源外，可能還有其他尚未確定的內(nèi)源性甲烷產(chǎn)生的來源[47]。Methanobrevibacter smithii和Methanosphaera stadtmanae是人類結(jié)腸中主要的甲烷生產(chǎn)者。它們的數(shù)量沿著結(jié)腸增加，直到在直腸達(dá)到最大值[48]。Methanobrevibacter smithii利用氫氣將二氧化碳還原為甲烷，而Methanosphaera stadtmanae則利用氫氣將甲醇還原為甲烷[49, 50]。合成一個甲烷分子需要四個氫分子和一個二氧化碳分子：二氧化碳 + 4氫氣 → 甲烷 + 2H2O。腸道微生物群中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量隨著年齡的變化而變化。通常，新生兒的腸道微生物群不含有產(chǎn)甲烷菌[46]，以及三歲以下的兒童[51]。隨著年齡的增長，產(chǎn)甲烷的人類比例增加，80-90歲年齡組的比例達(dá)到40-77%[52, 53]。我們推測，高產(chǎn)甲烷的大鼠可以作為老年人微生物群的模型。 通過使用不可消化的碳水化合物乳果糖、瓜爾膠（化學(xué)結(jié)構(gòu)為100%瓜爾豆半乳甘露聚糖，由曼諾糖和半乳糖以大約2:1的比例組成）和菊粉（D-果糖的聚合物）負(fù)荷的呼吸測試，僅在產(chǎn)氫大鼠中引發(fā)了不同數(shù)量的氫氣增加。在給予乳果糖后，氫氣反應(yīng)的最大增加，盡管食物纖維（瓜爾膠和菊粉）的劑量是乳果糖的兩倍，但是瓜爾膠和菊粉引起的氫氣反應(yīng)的幅度較低。Bond和Levitt在人類上的實驗中也顯示了類似的結(jié)果。這種個體碳水化合物在產(chǎn)氫效果上的差異已在體外[24, 54]和體內(nèi)實驗[22]中顯示，并可以通過宿主微生物群的分類組成差異來解釋。例如，半乳甘露聚糖主要由B. ovatus降解，而菊粉則由Bacteroides ovatus和Bacteroides caccae降解[55]。乳果糖最大的氫氣刺激效果可以解釋為其簡單的結(jié)構(gòu)（人造二糖，含有果糖和半乳糖），并且在人類糞便中篩選出35種能夠利用乳果糖的物種[56]。 在產(chǎn)甲烷的大鼠組中觀察到所有研究的碳水化合物的意外效果。給予任何一種三種研究的碳水化合物后，僅伴隨著甲烷產(chǎn)量的增加。在人類研究中也展示了類似的結(jié)果[21, 23]。腸道微生物群產(chǎn)生的氫氣可以被幾種氫營養(yǎng)體消耗，如產(chǎn)甲烷的古菌、產(chǎn)生硫化氫的硫酸還原細(xì)菌和產(chǎn)醋菌[57]。不同種類的產(chǎn)甲烷古菌利用氫氣與二氧化碳、甲醇或三甲胺（TMA）合成甲烷[10, 58]。由于合成甲烷需要氫氣的存在，因此不能說產(chǎn)甲烷的人類或動物不產(chǎn)生氫氣。我們假設(shè)，導(dǎo)致僅產(chǎn)生甲烷的碳水化合物負(fù)荷實驗的結(jié)果可以通過存在高活性的氫營養(yǎng)體（本例中為甲烷菌）來解釋，它們消耗了任何可用的氫氣。Ruaud等人進(jìn)行的優(yōu)雅研究結(jié)果為我們的假設(shè)提供了強(qiáng)有力的支持，他們能夠培養(yǎng)出這樣的厭氧菌，如產(chǎn)氫的Christensenella和產(chǎn)甲烷的Methanobrevibacter。在單獨培養(yǎng)時，Christensenella細(xì)菌產(chǎn)生氫氣，而Methanobrevibacter古菌產(chǎn)生甲烷。當(dāng)兩種微生物在同一管中培養(yǎng)時，它們形成了緊密接觸，稱為團(tuán)塊，Christensenella產(chǎn)生的全部氫氣被Methanobrevibacter消耗[41]。氫氣產(chǎn)生菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和氫營養(yǎng)體（Desulfovibrio vulgaris）產(chǎn)生硫化氫的配對也顯示了類似的效果[59]。 為了評估腸道菌群的總體發(fā)酵能力，我們認(rèn)為方式是評估原始的、初級產(chǎn)生的氫氣(氫氣)總量，這些氫氣可能隨后通過肺部呼出，被不同的氫營養(yǎng)菌消耗。初級產(chǎn)生的氫氣總量可以計算為呼出的氫氣（單位為ppm）和呼出的甲烷（單位為ppm）的總和乘以4的系數(shù)。這種計算方法在之前的研究[60]中已被采用。我們假設(shè)這項研究的結(jié)果對于健康飲食建議以及提高機(jī)體的抗氧化能力具有重要意義。增加食物纖維的攝入是眾所周知的建議，但如果腸道菌群的高產(chǎn)甲烷活性很高，這將是無效的。我們認(rèn)為飲用富含氫的水將導(dǎo)致氫氣在胃腸道上部被吸收，擴(kuò)散到血液中，并通過門靜脈系統(tǒng)到達(dá)肝臟，起到抗氧化劑的作用。 關(guān)于菌群發(fā)酵活性研究方法的簡報。在臨床研究中，用于診斷小腸細(xì)菌過度生長（SIBO）、吸收不良、不同碳水化合物的耐受性、口盲腸傳輸時間以及其他一些病狀，氫氣呼吸測試占主導(dǎo)地位。在大多數(shù)關(guān)于嚙齒類動物（小鼠和大鼠）的實驗研究中，動物被放置在密封的玻璃瓶或代謝籠中[25, 61,62,63,64]。 這種方法與人類的呼吸測試不同，因為在密封空間中偶爾排氣（放屁）時，高濃度（以%計，而非像呼出空氣中的ppm）的腸道氣體會產(chǎn)生所研究氣體濃度的峰值，從而增加了結(jié)果的離散度。在這項工作中，我們使用了一個改良的僅鼻系統(tǒng)結(jié)合Allay?約束項圈[26, 27]來簡化呼吸測試程序，并僅收集大鼠呼出氣中的氫氣，這使得該方法接近人類的呼吸測試，并便于將實驗結(jié)果與臨床結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)論 不同食物纖維在增加內(nèi)源性氫氣釋放方面的有效性取決于菌群中氫氣產(chǎn)生菌和甲烷產(chǎn)生菌的豐度比。甲烷產(chǎn)生菌的呈現(xiàn)越高，食物纖維的氫氣刺激效果就越低。由于隨著年齡的增長，產(chǎn)甲烷菌的比例更高，我們推測對施用的食物纖維的積極反應(yīng)會更低。我們認(rèn)為，對于老年人群體來說，飲用富含氫的水或吸入氫氣以提高機(jī)體的抗氧化保護(hù)將更為有效
